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本制品是由大肠杆菌表达的重组禽类成髓细胞瘤逆转录酶。AMV RTase是一个异源二聚体，由两个不同的亚基组成（alpha 65 KDa和beta 94 KDa亚基）。AMV RTase具有多种活性，包括RNA和DNA依赖的DNA聚合酶活性、DNA-RNA解旋活性、序列特异的Mn²⁺依赖性内切核酸酶活性和RNase H (45～60℃)内保持活性，因此可逆转录含有大量二级结构复杂的RNA。

活性温度37～58℃范围内热稳定性高，逆转录温度可达60℃，高效制备全长的第一链cDNA，最长可达13kb。

• 第一链cDNA合成，用于RT-PCR和实时RT-PCR；
  
• 可提高反应温度降低二级结构对逆转录的影响；
  
• 合成cDNA，用于克隆和表达研究；
  
• 合成标记的cDNA探针；
  
• 引物延伸法分析RNA。

Avian myeloblastosis virusparticles。


一个活性单位是指在37℃、10min内催化将1nmol脱氧核苷酸转移到酸性沉淀物质中所需的酶量。

组分	200U	1000U
AMV反转录酶(10U/μL)	20μL	100μL
5×AMV Reaction Buffer	100μL	200μL

保存：-20℃，避免反复冻融，有效期2年。


200mM磷酸钾（pH7.2，4℃），2mM DTT，0.2% (V/V) Triton X-100和50% (V/V)甘油。


5×AMV Reaction Buffer：
250mM Tris-HCl（pH8.3，25℃）、250mM KCl、50mM MgCl₂、2.5mM精胺、50mM DTT。


85℃加热5分钟。


金属螯合剂和无机磷酸盐。焦磷酸钠可降低AMV RTase活性，但是当其浓度≤4mM时可增加全长cDNA的产量。

• 实验过程中注意避免RNase污染，RNA样品要避免基因组DNA污染。用于cDNA合成的器具须用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液37℃浸泡12h；然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
  
• 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60min)或者上述DEPC处理的器具盛装，使用的无菌水须用0.1% DEPC处理后进行高温高压灭菌。建议RNA实验使用的器具、试剂和无菌水专用。
  
• RNA模板的完整性对cDNA合成效率起着决定性作用，请选择可靠的RNA提取/纯化方法。
  
• 由于所有的RNA提取方法都不能完全去除基因组DNA，所以应根据后续实验需求，选择是否需要在反转录反应前去除残留基因组DNA。
  
• AMV RTase以RNA为模板获得第一链cDNA，其起始位点由所使用的引物决定：
  
  • 随机引物（Random Primer）在RNA模板上随机结合。
    
  • Oligo dT Primer只能以poly（A）mRNA作为cDNA合成模板。
    
  • 基因特异性引物（GSP）以其特异性结合位点为起始位点。
• AMV RTase合成第一链cDNA产物可直接加入PCR反应混合物中进行扩增，但加入体积不应超过PCR反应总体系的10%，否则影响目的片段的产量。PCR扩增使用的耐热DNA聚合酶和热循环条件需要根据目的片段大小，GC含量，引物特性以及对保真度的要求进行选择。
  
• AMV RTase的5×AMV Reaction Buffer仅用于cDNA第一链的合成，不能用于M-MLV逆转录酶。
  
• 第一链cDNA合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板，合成含各种标记的cDNA，作为杂交实验的探针。
  
• RNA应置于-70℃以下保存，cDNA合成产物应置于-20℃保存。

一、cDNA第一链合成操作方法：

• 自备试剂：
  以2μg RNA反转录进行说明，以下试剂用户自备：
  
  • 10mM dNTP mix
    
  • Ribonuclease Inhibitor
    
  • 40mM焦磷酸钠，预热至42℃
    
  • Oligo(dT)或随机六聚体引物
    
  • 无核酸酶的水
    
  • EDTA (50mM)
    
  • [α-³²P]dCTP (>400 Ci/mmol,10 mCi/ml)
• 操作步骤：
  
  • 在无菌且无核酸酶的离心管中加入引物和RNA模板，以0.5μg引物/μg RNA的比例加DEPC H2O制样且总体积≤11μL（切勿更改引物和模板的比例），70℃孵育5min后冰浴5min，短暂离心收集溶液到离心管底部。
    
  • 按下表一次加入各成分：
    

    成分	用量
    5×AMV Reaction Buffer	5μL
    dNTP mix	2.5μL
    RNasin	40U
    40mM焦磷酸钠(预热至42℃)	2.5μL
    AMV RTase	30U
    Nuclease-Free Water	至25μL

  • 轻轻混匀，转移5μL反应混合物到另一个含有2-5 μCi[α³²P] dCTP的管中。剩余20μL不进行标记。
    注意：我们建议使用小于1周的[α-³²P] dCTP。
    
  • 若使用oligo(dT)则42℃孵育60min，若使用随机六聚体引物则37℃孵育60min。
    
  • 将标记和未标记的反应物置于冰上，并向其中加入95μL 50mM EDTA标记的（示踪剂）反应。现在反应体积应该是100μL。示踪剂反应可以用于掺入测定和凝胶分析。

相关搜索：AMV反转录酶，AMV逆转录酶，AMV RTase，AMV Reverse Transcriptase，10U/μL